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凱氏定氮法測蛋白質含量
發布時間:2016-07-27 22:21:23 來源: 作者: 【 】 瀏覽:4203
凱氏定氮法測蛋白質含量
一、原理
  蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質分解,分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量乘以換算系數,即為蛋白質含量。 
  1. 有機物中的胺根在強熱和CuSO4,濃H2SO4 作用下,硝化生成(NH42SO4 
 
反應式為: 
  2NH2+H2S04+2H=(NH4)2S04 (其中CuSO4做催化劑) 
  2. 在凱氏定氮器中與堿作用,通過蒸餾釋放出NH3 ,收集于H3BO3 溶液中 
  反應式為:
  (NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 
  2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
  3. 用已知濃度的H2SO4(或HCI)標準溶液滴定,根據HCI消耗的量計算出氮的含量,然后乘以相應的換算因子,既得蛋白質的含量 
  反應式為: 
  (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 
  (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3 
二、試劑
  所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制。 
  硫酸銅。 
  硫酸鉀。 
  硫酸。 
  2%硼酸溶液。 
  混合指示液:1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時混合。 
  40%氫氧化鈉溶液。 
  0.025mol/L硫酸標準溶液或0.05mol/L鹽酸標準溶液。 
三、儀器
  定氮蒸餾裝置:如圖所示。 
   

凱氏定氮法儀器
1.安全管 
  2.導管 
  3.汽水分離管 
  4.樣品入口 
  5.塞子 
  6.冷凝管 
  7.吸收瓶 
  8.隔熱液套 
  9.反應管 
  10.蒸汽發生瓶 
四、操作方法
  1 樣品處理:精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品(約相當氮30-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸銅,6g硫酸鉀及20毫升硫酸,稍搖勻后于瓶口放一小漏斗,將瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網上,小火加熱,待內容物全部炭化,泡沫完全停止后,加強火力,并保持瓶內液體微沸,至液體呈藍綠色澄清透明后,再繼續加熱0.5小時。取下放冷,小心加20ml水,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸同一方法做試劑空白試驗。 
  2 按圖裝好定氮裝置,于水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入數粒玻璃珠以防暴沸,用調壓器控制,加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。 
  3 向接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室,并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內,塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其緩慢流入反應室,立即將玻璃蓋塞緊,并加水于小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾,開始蒸餾,蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內,蒸餾5min。移動接收瓶,使冷凝管下端離開液皿,再蒸餾1min,然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶,以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標準溶液定至灰色或藍紫色為終點。 
  同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。 
五、計算
  X =((V1-V2)*N*0.014)/( m*(10/100)) *F*100%  
  X:樣品中蛋白質的百分含量,g; 
  V1:樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積,ml; 
  V2:試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積,ml; 
  N:硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度; 
  0.014:1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當于氮克數; 
  m:樣品的質量(體積),g(ml); 
  F:氮換算為蛋白質的系數蛋白質中的氮含量一般為15~17.6%,按16%計算乘以6.25即為蛋白質,乳制品為6.38,面粉為5.70,玉米、高粱為6.24,花生為5.46,米為5.95,大豆及其制品為5.71,肉與肉制品為6.25,大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83,芝麻、向日葵為 5.30。 
六、注意事項
  (1) 樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻,液體樣品應振搖或攪拌均勻。 
  (2) 樣品放入定氮瓶內時,不要沾附頸上。萬一沾附可用少量水沖下,以免被檢樣消化不完全,結果偏低。 
  (3) 硝化時如不容易呈透明溶液,可將定氮瓶放冷后,慢慢加入30%過氧化氫(H2O2)2-3ml,促使氧化。 
  (4) 在整個消化過程中,不要用強火。保持和緩的沸騰,使火力集中在凱氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下,使氮有損失。 
  (5) 如硫酸缺少,過多的硫酸鉀會引起氨的損失,這樣會形成硫酸氫鉀,而不與氨作用。因此,當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時,要增加硫酸的量。 
  (6) 加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點,硫酸銅為催化劑,硫酸銅在蒸餾時作堿性反應的指示劑。 
  (7) 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠,可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。 
  (8) 氨是否完全蒸餾出來,可用PH試紙試餾出液是否為堿性。 
  (9) 吸收液也可以用0.01當量的酸代表硼酸,過剩的酸液用0.01N堿液滴定,計算時,A為試劑空白消耗堿液數,B為樣品消耗堿液數,N為堿液濃度,其余均相同。 
  (10) 以硼酸為氨的吸收液,可省去標定堿液的操作,且硼酸的體積要求并不嚴格,亦可免去用移液管,操作比較簡便。 
  (11) 向蒸餾瓶中加入濃堿時,往往出現褐色沉淀物,這是由于分解促進堿與加入的硫酸銅反應,生成氫氧化銅,經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用,生成深l藍色的結合物[Cu(NH3)4]2+
  (12) 這種測算方法本質是測出氮的含量,再作蛋白質含量的估算。只有在被測物的組成是蛋白質時才能用此方法來估算蛋白質含量。 
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